Mikroorganisme

PEWARNAAN BTA UNTUK PEMERIKSAAN TBC

DASAR TEORI

 

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode  pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan  pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC  berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).

 

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan  pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997). Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, ketika Mycobacteria diberi warna oleh  pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nicardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida (Thomas, 1999). Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau  pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam  jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4

 – 

3 μm.

Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat

 

didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif  berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang  berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001). Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi  beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-

23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada

 bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada  bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur  petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum: Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi. Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu. Collection sputum: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam 

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna  pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu  pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori- pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu : 1.

Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast). 2.

Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast). Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005). Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M.

 

tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen  blue pada bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980). Standar yang terdapat dalam IUATLD (International Union Against Tuberculosis Lung Disease) seperti berikut : -

 Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA -

Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP -

Positif 1 : Ditemukan 10-99 BTA/100 LP -

Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP -

Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP

 

 

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.

 

A.CARA PENGAMBILAN SPUTUM

Tujuan

Mendapatkan spesimen sputum yang memenuhi persyaratan untuk pemeriksaan pewarnaan basil tahan asam
2. Indikasi
Pasien yang mengalami infeksi/peradangan saluran pernafasan (apabila diperlukan).
3. Waktu
Diperlukan 3 kali pengambilan ssputum dalam 2 kali kunjungan, yaitu
• Sputum sewaktu (S), yaitu ketika penderita pertama kali datang
• Sputum pagi (P) , keesokan harinya ketika penderita datang lagi dengan membawa sputum pagi (sputum pertama setelah bangun tidur)
• Sputum sewaktu (S), yaitu saat penderita tiba di laboratorium.,penderita diminta mengeluarkan sputumnya lagi.
4. Persiapan Alat
a. Sputum pot (tempat ludah) yang bertutup
b. Botol bersih dengan penutup
c. Hand scoon
d. Formulir dan etiket
e. Perlak
f. pengalas
g. Bengkok
h. Tissue

5. Persiapan pasien
Jelaskan pada pasien apa yang dimaksud dengan sputum agar yang dibatukkan benar-benar merupakan sputum, bukan air liur/saliva ataupun campuran antara sputum dan saliva. Selanjutnya, jelaskan cara mengeluarkan sputum.

6. Prosedur Tindakan
a. Menyiapkan alat
b. Memberitahu pasien
c. Mencuci tangan
d. Mengatur posisi duduk

e. Memasang perlak pengalas dibawah dagu.
f. Memakai hand scoon
g. Meminta pasien membatukkan dahaknya ke dalam tempat yang sudah disiapkan (sputum pot)
h. Mengambil 5cc bahan, lalu masukkan ke dalam botol
i. Membersihkan mulut pasien dengan tissu
j. Merapikan pasien dan alat
k. Melepas hand scoon
l. Mencuci tangan

B.CARA PENGIRIMAN SPECIMEN
Baik spesimen yang dikirim dalam pot maupun wadah harus disertai dengan data/keterangan, baik mengenai kriteria spesimen maupun pasien. Ada 2 data yang harus disertakan, yaitu:

1. Data 1:
Pot/wadah dilabel dengan menempelkan label pada dinding luar pot. Proses direct labelling yang berisi data: nama, umur, jenis kelamin, jenis spesimen jenis tes yang diminta dan tanggal pengambilan.
2. Data 2:
Formulir/kertas/buku yang berisi data keterangan klinis: dokter yang mengirim, riwayat anamnesis, riwayat pemberian antibiotik terakhir(minimal 3 hari harus dihentikan sebelum pengambilan spesimen), waktu pengambilan spesimen, dan keterangan lebih lanjut mengenai biodata pasien.Jadi, data mengenai spesimen harus jelas: label dan formulir.Spesimen tidak akan diterima apabila:
- Tidak dilengkapi dengan data yang sesuai.
- Jumlah yang dibutuhkan untuk pemeriksaan kurang
- Cara pengambilan tidak sesuai dengan prosedur yang ada


C.HAL-HAL YANG PERLU di PERHATIKAN
Pengambilan sputum sebaiknya dilakukan pada pagi hari, dimana kemungkinan untuk mendapat sputum bagian dalam lebih besar. Atau juga bisa diambilsputum sewaktu. Pengambilan sputum juga harus dilakukan
sebelum pasien menyikat gigi.Agar sputum mudah dikeluarkan, dianjurkan pasien mengonsumsi air yang banyak pada malam sebelum pengambilan sputum. Sebelum mengeluarkan sputum, pasien disuruh untuk berkumur-kumur dengan air dan pasien harus melepas gigi palsu(bila ada).Sputum diambil dari batukkan pertama(first cough).

Cara membatukkan sputum dengan Tarik nafas dalam dan kuat(dengan pernafasan dada)batukkan kuat sputum dari bronkustrakeamulutwadah penampung.Wadah penampung berupa pot steril bermulut besar dan berpenutup(Screw Cap Medium).
Periksa sputum yang dibatukkan, bila ternyata yang dibatukkan adalah air liur/saliva, maka pasien harus mengulangi membatukkan sputum.Sebaiknya, pilih sputum yang mengandung unsur-unsur khusus,
seperti, butir keju, darah dan unsur-unsur lain.Bila sputum susah keluarlakukan perawatan mulut
Perawatan mulut dilakukan dengan obat glyseril guayakolat(expectorant) 200 mg atau dengan mengonsumsi air teh manis saat malam sebelum pengambilan sputum.
Bila sputum juga tidak bisa didahakkan, sputum dapat diambil secara:
- Aspirasi transtracheal
- Bronchial lavage
- Lung biopsy 

D.CARA PEWARNAAN BTA

 Alat 1 :

Lidi/ Ose .

Api Spiritus .

Object Glass .

Mikroskop Binokuler .

Rak Tabung .

Label  .

Bahan 1.

Sputum (sampel sputum Ayu Dian Puspita 1 dan 2) 2.

Sampel BTA (1, 2 dan 3) 3.

Oil Imersi 4.

Lens Paper 5.

Tissue c.

Reagensia / cat 1.

Carbol Fuchsin 0,3% 2.

Asam Alkohol 3% 3.

Methylene Blue 4.

Aquadest

 

CARA KERJANYA

Pembuatan Apusan 1.

Digunakan semua APD dengan baik, benar dan lengkap. 2.

Disiapkan semua alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan. 3.

Dipastikan semua alat dan bahan siap untuk digunakan. 4.

Diambil lidi/ose lalu dipanaskan dengan api Bunsen. 5.

Dibuka tutup wadah sampel yang berisi sampel sputum. 6.

Dimasukkan lidi/ose secara perlahan. 7.

Dibakar lidi/ose, kemudian diletakkan dirak ose. 8.

Dikeringkan apusan pada object glass dengan api Bunsen atau difiksasi. 9.

Dilakukan fiksasi dengan cara mengelilingi kaca preparat pada api Bunsen sebanyak tiga kali.  b.

 Pewarnaan 1.

diteteskan Zat ZN A (Carbol Fuchsin) pada kaca preparat kemudian dipanaskan sampai menguap (jangan sampai mendiih), ditunggu 5 menit lalu dibilas dengan aquadest. 2.

Diteteskan ZN B (Asam Alkohol) pada kaca preparat, ditunggu hingga ½ menit lalu dibilas dengan aquadest. 3.

Diteteskan ZN C (Methylene Blue), ditunggu hingga 1 menit lalu dibilas dengan aquadest. 4.

Dikeringkan dengan kertas tissue. c.

Pembacaan Hasil Pengamatan 1.

Preparat yang sudah jadi diamati dibawah mikroskop dengan setting pembesaran objektif 10 kali untuk mencari lapang pandang, kemudian dilanjutkan dengan  perbesaran objektif 100 kali dengan penambahan oil imersi untuk memperjelas objek yang diamati. 2.

Diamati bentuk dan warna bakteri, bakteri tahan asam akan berwarna merah dan  bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru. 

PENGAMATAN 

 

PEMBAHASAN

Pembuatan dan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)

Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam (BTA) yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl-Neelson (ZN) yaitu carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 % dan methylene blue 3 %. Dalam pengecatan ini digunakan sample sputum. Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak yang menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain yang ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri menjadi lebih mudah, tetapi apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis. Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson yng menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut : 1.

Pewarnaan dengan Carbol Fuchsin 3 % Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus dinding dari Bakteri tahan asam, sehingga dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel bakteri tersebut sehingga warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan,  pemanasan dilalukan jangan sampai mendidih cukup samapai menguap agar sel-sel  bakteri tersebut tidak rusak. 2.

Penambahan larutan asam alkohol 0,3 % Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna (decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam  pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alkohol ditunggu samapai 5 menit. Saat penambahan asam alkohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan

 

dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA. 3.

Pemberian zat warna Methylene Blue Terakhir dilakukan penambahan Methylene blue. Methylene Blue merupakan  pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol. Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna  biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori

 – 

 pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Waktu yang dipelukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda. Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat pembacaan preparat pada mikroskop. 1.

Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan pemanasan. 2.

 Warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. 3.

 Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene  blue bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA. Setelah pewarnaan dan menunggu selama waktu diatas, dilakukan pembilasan dengan aquadest yang bertujuan untuk membilas zat warna yang berlebih sebelum dilanjutkan dengan pewarnaan berikutnya.

Hal yang perlu diperhatikan

Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna yang tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol jangan sampai berlebih

 

karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan  Non BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel BTA. Kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades diantara penambahan pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna berikutnya.

Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA

Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada komponen dinding selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin (lapisan lemak) yang sangat  banyak sehingga dalam proses penyrapan warna perlu dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel tersebut sehingga pewarna dapat diserap. Namun dalam dinding sel bakteri non BTA lapisan lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakuka  penyerapan warna tidak perlu dilakukan pemanasan dan pelunturan warna pun sangat mudah dilakukan saat penambahan asam alkohol.